基于免疫级联反应的蚕蛹浆比色法在关节假体周围感 染精准诊断中的实验研究

作者:在线查重系统     发表时间:2022-03-28 17:05:54   浏览次数:24


摘    要:目的 探讨蚕蛹浆(silkworm larvae plasma,SLP)比色法在关节假体周围感染(periprosthetic joint infection,PJI)精准诊断中的应用价值。方法 取90只健康雄性新西兰大白兔,采用Swanson假体行膝关节置换手术;然后根据致病菌不同随机分为3组:A组(金黄色葡萄球菌组)、B组(表皮葡萄球菌组)及C组(大肠埃希菌组),每组30只。术后第3天膝关节腔内注射1 mL不同浓度致病菌制备PJI模型。分别于接种菌液前及接种后7、14、21 d取样进行检测,参照2018年PJI费城国际共识诊断标准首先判定并计算3组实验动物的造模成功率,并采用SLP比色法计算其在PJI精准诊断中的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和诊断效率。结果接种菌液21 d时,A、B、C组分别有26、18、23只实验动物诊断为感染,造模成功率分别为86.7%、60.0%、76.7%,3组间比较差异无统计学意义(χ2=5.724,P=0.073)。PJI比色法结果显示,A组在7 d时出现1只假阳性动物(特异性75.0%),随时间推移(14、21 d)SLP的特异性升至100.0%;14、21 d,另出现了1只假阴性动物(敏感性由100.0%降至96.2%)。B组在7 d时出现1只假阳性动物(特异性91.7%),随着时间推移特异性回升至100.0%;在14、21 d时分别出现1只和4只假阴性动物(敏感性分别为94.4%及83.3%)。C组在7 d时有2只假阳性动物(特异性71.4%),随后回升至100.0%。A、C组在21 d时诊断效率极高(96.7%和100.0%);即使面对B组低毒力的表皮葡萄球菌,21 d时SLP的诊断效率也可保持在90.0%;总体诊断效率很好(95.6%)。结论 SLP比色法诊断PJI具有较高的敏感性、特异性以及诊断效率,是一种极具潜能的PJI诊断方法。


关键词:蚕蛹浆比色法;关节假体周围感染,精准诊断;



Experimental study of silkworm larvae plasma colorimetry based on immune cascade

reaction in accurate diagnosis of periprosthetic joint infection

ZHANG Chi WANG Yuanhe SUN Kang TIAN Shaoqi

Department of Joint Surgery, Yantai filiated Hospital of Binzhou Medical University Department

of Joint Surgery, the ffliated Hospital of Qingdao University



Abstract:Objective To investigate the diagnostic efficacy of silkworm larvae plasma(SLP) colorimetry in the accurate diagnosis of periprosthetic joint infection(PJI). Methods Ninety healthy male New Zealand white rabbits were used for knee arthroplasty with Swanson prosthesis. Then they were randomly divided into 3 groups according to different pathogenic bacteria: group A(Staphylococcus aureus group), group B(Staphylococcus epidermidis group) and group C(Escherichia coli group), with 30 rats in each group. The PJI model was prepared by knee injection with 1 mL of pathogenic bacteria of different concentrations. Samples were taken before inoculation and at 7, 14, and 21 days after inoculation, and based on the 2018 PJI Philadelphia International Consensus diagnostic criteria, the success rate of modeling among 3 groups of experimental animals was determined. The sensitivity, specificity, positive predictive value,negative predictive value, and diagnostic efficiency of SLP colorimetry were calculated. Results At 21 days after inoculation, 26, 18, and 23 rabbits in groups A, B, and C were diagnosed as infection, respectively. The success rates of modeling were 86.7%, 60.0%, and 76.7%, respectively, showing no significant difference among the 3 groups(χ2=5.724,P=0.073). The results of PJI colorimetry showed that 1 false-positive animal(specificity 75.0%) appeared in group A at 7 days, and the specificity of SLP increased to 100.0% over time(on 14 and 21 days); on 14 and 21 days, another animal appeared false-negative results(sensitivity decreased from 100.0% to 96.2%). One false-positive animal appeared in group B at 7 days(specificity 91.7%), the specificity returned to 100.0% over time; 1 and 4 false-negative animals appeared at 14 and 21 days, respectively(sensitivity 94.4% and 83.3%, respectively). In group C, two false-positive animals(specificity71.4%) were found at 7 days, and then returned to 100.0%. The diagnostic efficiency of groups A and C was very high at 21 days(96.7% and 100.0%), even for the low virulence Staphylococcus epidermidis in group B, the diagnostic efficiency could be maintained at 90.0%(21 days), and the overall diagnostic efficiency was very good(95.6%). Conclusion SLP colorimetry has high sensitivity, specificity, and diagnostic efficiency in the diagnosis of PJI, which is a potential diagnostic method.


Keyword:Silkworm larvae plasma colorimetry; periprosthetic joint infection; precise diagnosis;


在人工关节置换术并发症中,最严重的是假体周围感染(periprosthetic joint infection,PJI)[1]。早期准确诊断PJI是及时、有效治疗并取得良好预后的前提条件[2]。早期(术后3个月内发生)PJI主要由强毒力致病菌引起[3],症状较为明显,诊断难度相对较小;而迟发型(术后3~12个月)与晚期(术后12个月以后)PJI主要由低毒力致病菌(如表皮葡萄球菌)引起[4],在假体表面形成生物膜后PJI更加难以诊断。为了解决PJI诊断困难的问题,多个医学协会及团体提出了各自的共识或定义[5,6],其中2018年PJI费城国际共识被学界公认为目前PJI诊断的“金标准”[7]。但是综合分析各标准均存在一些问题,给临床使用带来诸多不便。


蚕蛹浆(silkworm larvae plasma,SLP)试剂是从蚕蛹血浆中提纯的生物试剂,它可特异性识别细菌及真菌细胞壁中的肽聚糖(peptidoglycan,PG)及β-葡聚糖(β-glucan,BG),并启动免疫级联反应,使反应底物变黑[8],故SLP比色法理论上可能成为检测PJI的全新检测手段。本研究拟通过新西兰大白兔PJI动物模型,检验SLP比色法在PJI精准诊断方面的效能。


1 材料与方法

1.1 实验动物、假体、菌株及主要试剂、仪器

12~16周龄健康雄性新西兰大白兔90只,体质量2.5~2.7 kg,购自青岛康大生物科技有限公司。实验动物膝关节置换假体选用Swanson假体(Wright Medical Group公司,美国)。金黄色葡萄球菌(CICC 10145)、表皮葡萄球菌(CICC 10398)及大肠埃希菌(CICC 20658)均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。SLP试剂盒[日本Wako(和光纯药)株式会社];兔C反应蛋白(C reactive protein,CRP)ELISA96T试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)。全自动血沉仪(Stago公司,法国);全自动血液体液分析仪(Sysmex株式会社,日本);比浊仪(GRANT公司,英国)。


1.2 PJI动物模型制备

1.2.1 动物麻醉

所有实验动物以1%戊巴比妥钠(3 mL/kg)腹腔注射麻醉[9]。由于兔对戊巴比妥钠的耐受剂量较窄且存在个体差异,易引起呼吸衰竭致死,所以将兔固定于固定箱后,先给予总麻醉剂量的2/3,观察实验动物反应10~15 min,15 min后如果兔角膜反射依然存在,再给予剩余1/3麻醉剂量。由于给予的麻醉剂量较少,本研究术前及手术结束后均采用利多卡因行膝关节周围浸润性麻醉以减少实验动物痛苦。


1.2.2 兔膝关节置换手术

麻醉效果满意后,取右侧膝关节正中切口入路,逐层切开分离皮下组织至髌韧带处并电凝止血;经髌旁内侧入路切开关节囊,屈曲膝关节并外翻髌骨以显露膝关节内部结构。切除前、后交叉韧带及半月板,使股骨和胫骨分离。先行股骨截骨,截骨时需注意勿损伤膝关节后方血管和神经,再向前牵拉胫骨使其脱位行胫骨截骨。截骨后扩髓,植入Swanson5-0假体,检查假体松紧情况和膝关节屈伸活动度。将髌骨复位后再次检查膝关节屈伸活动情况,确保无软组织嵌入、股骨和胫骨处摩擦,并检查假体稳定性。充分电凝止血后,按聚维酮碘溶液、生理盐水、双氧水、生理盐水的顺序冲洗关节2次。以连续锁边缝合方式缝合关节囊,单纯间断缝合手术切口。见图1。


1.2.3实验分组及方法

膝关节置换术后将实验动物随机分为3组:A组(金黄色葡萄球菌组)、B组(表皮葡萄球菌组)及C组(大肠埃希菌组),每组30只。A、B、C组动物周龄分别为(14.5±1.1)、(14.5±1.1)、(14.4±1.1)周,体质量分别为(2.597±0.465)、(2.599±0.475)、(2.601±0.474)kg,组间比较差异均无统计学意义(F=0.857,P=0.664;F=0.628,P=0.872)。


术后当日及第1、2天肌肉注射青霉素钠(3×104 U/kg)预防感染,术后第3天取金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及大肠埃希菌菌液以比浊仪分别稀释至1×105、1×107、1×105 CFU/mL[10];各取1 mL菌液注射入各组实验动物关节腔进行PJI造模。


1.3 实验动物造模成功率判定

各组分别于接种菌液前及接种后7、14、21 d经耳缘静脉采血、关节腔穿刺采集关节液。取血清样本,采用兔CRP ELISA96T试剂盒检测CRP蛋白表达,采用全自动血沉仪检测红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR);取关节液样本,采用全自动血液体液分析仪进行白细胞计数和多形核粒细胞百分比检测。接种菌液后21 d处死实验动物,取置换侧膝关节,切片后行HE染色观察。依据2018年PJI费城国际共识的诊断标准(表1)判定3组实验动物造模是否成功,并计算成功率。2018年PJI费城国际共识中的诊断阈值为人用,故我们做了预实验,确定了新西兰大白兔接种菌液后21 d时相应的诊断阈值。A、B、C组的血清CRP诊断阈值分别为18.64、9.22、10.62 mg/L,ESR诊断阈值分别为9.45、6.00、5.65 mm/1 h;关节液白细胞计数诊断阈值分别为71.5×106/L、75.5×106/L及66.0×106/L,多形核粒细胞百分比诊断阈值分别为71.5%、58.5%及55.0%。


1.4 SLP试剂诊断PJI

将无菌水、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及大肠埃希菌菌液以及接种前、接种后7、14、21 d的血清和关节液各500μL分别加入96孔板中,迅速在每孔中加入500μL SLP检测溶液后加盖;30℃恒温水浴60 min,采用微孔板目测比色法,样本变为黑色为阳性,否则为阴性。其中无菌水为阴性对照,3种菌液为标准阳性对照;关节液及血液样本中有1项为阳性,即为阳性。通过以下公式计算SLP试剂诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和诊断效率。敏感性=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%;特异性=真阴性/(假阳性+真阴性)×100%;阳性预测值=真阳性/(真阳性+假阳性)×100%;阴性预测值=真阴性/(真阴性+假阴性)×100%;诊断效率=(真阳性+真阴性)/(真阳性+假阳性+真阴性+假阴性)×100%。


1.5 统计学方法

采用spss26.0统计软件进行分析。计量资料均符合正态分布,以均数±标准差表示,3组间周龄及体质量比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK检验;计数资料以率表示,组间比较采用χ2检验;检验水准α=0.05。


2 结果

2.1 实验动物造模成功判定

3组实验动物在接种菌液前均无感染,提示此后感染为细菌接种所致而非手术后感染。21 d时,A、B、C组分别有26、18、23只实验动物诊断为感染,造模成功率分别为86.7%、60.0%、76.7%,3组间比较差异无统计学意义(χ2=5.724,P=0.073)。


2.2 SLP试剂诊断PJI

A组在7 d时出现1只假阳性动物,导致特异性较低,仅为75.0%,7 d后随着细菌在动物体内被免疫系统清除,SLP特异性升至100.0%;14 d及21 d时另外1只实验动物出现了假阴性结果,导致SLP的敏感性降低至96.2%。B组在7 d时出现1只假阳性动物,导致其特异性为91.7%,与A组相同,1 4 d及2 1 d时S L P的特异性回升至100.0%;在14、21 d时分别出现1只和4只假阴性动物(敏感性分别为94.4%及83.3%)。C组在7 d时有2只假阳性动物,导致其特异性仅为71.4%,随着时间推移特异性回升至100.0%。A、C组高毒力致病菌在21 d时诊断效率分别为96.7%和100.0%,效能极好;B组细菌的致病力较低且容易形成生物膜,故诊断效率随着时间推移逐渐降低(由96.7%降至90.0%),但结果依然很好。见表2。


3 讨论

3.1 动物模型造模及检测时间点选择

近2年大部分以兔作为PJI造模动物的国内外实验研究均采用21 d作为造模期限[11,12],我们的预实验中超过21 d后高毒力致病菌组动物死亡数量明显增加,故本次造模选用21 d作为造模期限。因为B组为表皮葡萄球菌,其致病力较低且容易形成生物膜,从而在常规检测方法中呈现假阴性,所以我们在实验中设置了菌液接种后7 d和14 d作为检测点,以利于观察感染率的动态变化,体现SLP比色法的优势。


3.2 PJI诊断的难点

目前PJI的诊治是关节外科医师面临的重大难题之一,主要难点体现在早期诊断困难以及该并发症造成的严重后果[13]。目前2018年PJI费城国际共识是学术界公认的PJI诊断“金标准”[7],但其也存在一些问题:首先,诊断标准中存在很多主观评价标准(诸如脓苔等),在一些特殊情况(如金属碎屑及结晶沉积引起的关节炎)下也会产生类似于脓苔的产物,从而导致误判;其次,很多诊断指标的反馈周期较长(细菌培养),最终诊断延迟性很高,不适用于一些特殊情况(如术前诊断为假体无菌性松动,如何确定不是低毒力致病菌导致的PJI);再次,该诊断指标中存在主要指标、次要指标甚至是术后指标等复杂的评分系统,诊断较复杂,且部分患者如果不通过再次手术无法进行诊断,会给患者带来极大痛苦;最后,次要诊断指标只能间接反映感染或炎症的存在,无法直接检测病原微生物且受机体自身免疫水平影响较大。目前大多数国内学者在临床实践中遇到疑似PJI的患者,会首先进行关节液细菌培养,得到培养结果后再手术。但根据2018年PJI费城国际共识,细菌培养阳性仅为诸多诊断指标之一,诊断PJI不能仅依靠细菌培养结果。根据国内外近期文献报道,PJI大多数是由高毒力致病菌引起的[14,15]。但表皮葡萄球菌这种低毒力致病菌导致的PJI占总PJI患者的12.4%,其中难以治疗的PJI中表皮葡萄球菌占14.5%[16]。由表皮葡萄球菌导致的PJI患者中肯定存在细菌培养阴性者,或者存在培养出表皮葡萄球菌后难以与人体皮肤定植菌相鉴别的情况。对于这种怀疑为PJI但又无细菌学证据支持的患者,手术时如何处理则成为一大难题。因此出现了很多新型检测方法,如PCR及二代基因测序等基因水平检测。新型检测方法敏感性和特异性较好,但其缺点是结果回报时间太长,对于术中怀疑为PJI的患者无法做出快速、准确的诊断。如果对于这类患者进行翻修手术,病理学及微生物学结果回报后支持PJI的诊断,其灾难性后果是患者难以承受的。



3.3 SLP比色法的原理

Ashida于1981年发现了一种可以从家蚕蚕蛹体内提取完整血浆的方法[17]。随后人们发现存在于昆虫血浆及角质层中的前酚氧化酶(prophenoloxidase,proPO)在昆虫的防御机制中起着重要作用[18],在微生物(细菌和/或真菌)感染昆虫后会导致局部黑化。1986年Yoshida等[8]发现proPO级联反应由PG及BG启动,并由(1-3)-β-D-BG识别蛋白、PG识别蛋白、丝氨酸蛋白酶原、proPO以及一些未知成分组成。革兰阴性菌细胞壁中PG约占70%,革兰阳性菌为20%左右,BG则为真菌细胞壁的主要组成成分之一;故SLP检验理论上可以检测出细菌及真菌感染。目前商业化的SLP检测试剂是由蚕蛹体液中血浆部分制备,包含proPO级联反应所需的所有物质,可以与很少量PG和/或BG结合,通过级联反应不断扩大反应规模[19]。试剂中添加有左旋多巴作为酚氧化酶的反应底物,当级联反应被激活后,就可以观察到试剂变为黑色或深蓝色。


革兰阳性菌细胞壁中的PG裸露,而革兰阴性菌细胞壁中的PG被一层外膜包被,这在一定程度上会影响SLP的检测结果。从本研究中也可看出,随着时间推移,B组的诊断效率逐渐下降,主要原因是表皮葡萄球菌表面形成生物膜后,游离的细菌细胞壁明显减少;但本研究结果也显示,在表皮葡萄球菌形成生物膜后依然有着较高的诊断效率(90.0%)。超声裂解法可以破坏生物膜,使隐藏其中的细菌得以暴露,故理论上超声裂解法结合SLP检测可以提高细菌及真菌的检出率,我们已在进行相关研究。


3.4 SLP比色法的优势

本研究结果显示,SLP比色法对于PJI的总体诊断效能较好(95.6%~97.8%)。其中,A组在7 d时出现1只假阳性动物(特异性75.0%),我们认为这可能是由于SLP试剂对于PG敏感性极高,残留于关节腔中已死亡或低于致病浓度的金黄色葡萄球菌细胞壁与试剂反应导致的。而14、21 d,另1只实验动物出现了假阴性结果(敏感性96.2%),经培养发现其为金黄色葡萄球菌的小菌株变异,该变异菌株典型特征是生长代谢缓慢、菌落细小、毒力基因表达下调,以及与生物膜形成和黏附相关的主要基因表达增加[20];我们考虑产生假阴性的结果可能与其成生物膜特性有关。B组在7 d时出现1只假阳性动物(特异性91.7%),分析可能原因与A组相同;在14、21 d时分别出现1只和4只假阴性动物(敏感性分别为94.4%及83.3%),我们分析原因可能是随着时间推移,低毒力的表皮葡萄球菌开始在假体表面形成生物膜,产生假阴性结果。C组除7 d时有2只假阳性动物(特异性71.4%)外,14、21 d时敏感性、特异性以及诊断效率均极好(100%)。


目前关于SLP检测的文献较少,其中大多数是应用于微生物和工业领域[21],应用于医学方面的仅有3篇:①Kobayashi等[22]于2000年应用SLP检测患者是否存在细菌感染,发现其敏感性为86.2%、特异性为90.6%,而阳性预测值为89.3%、诊断效率为88.5%。②2003年Inada等[23]以SLP检测脑脊液并与普通及内毒素特异性鲎实验相结合,确定患者是否患有细菌或真菌性脑膜炎,并判断致病菌种类(真菌、革兰阴性菌或革兰阳性菌)。③2005年Shimizu等[24]利用SLP检测胃肠道手术后患者是否存在感染,并通过其变化预测患者发生感染性并发症的可能性。他们发现以术后第1天SLP预测感染并发症的效果最好,敏感性为66.7%、特异性为90.4%,曲线下面积为0.813±0.046。目前尚无将SLP比色法应用于关节外科,特别是PJI诊断方面的研究报道。


SLP检测有诸多优点:①方法简单,结果回报时间短,可以于术中使用;②价格相对较低,比白细胞酯酶和二代基因测序具有更高的效益-费用比;③直接检测病原微生物,敏感性及特异性高;④样本通用性强;⑤既可以检测细菌感染,也可以针对目前逐渐增多的真菌感染进行检测。


3.5 SLP比色法的局限性

本研究结果充分显示SLP比色法在诊断PJI方面具有较高的敏感性、特异性以及诊断效率。但本研究也存在一些局限性:动物模型的全身情况较为简单,与临床上发生PJI患者的全身状况(如糖尿病、风湿等其他基础疾病)有差异;SLP比色法对于细菌细胞壁中的PG敏感程度极高,这会导致假阳性的出现。SLP比色法能否在临床取得较为优异的诊断效率及良好的敏感性、特异性,尚需临床实践检验。


作者贡献:张驰负责实验构思、操作、资料总结分析及文章撰写;王远贺负责文献查阅及筛选、部分资料收集及实验动物的饲养,参与文章修改;孙康负责手术及麻醉相关指导,文章逻辑性修改及大体框架形成;田少奇负责实验设计、文章审阅、修改,硬件设施提供及基金支持。


利益冲突:所有作者声明,在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。项目经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。


机构伦理问题:所有动物实验经青岛大学附属医院医学伦理委员会批准。实验动物使用许可证号:SYXK(鲁)20190003。


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检查语种:中文,英文,小语种 预计时间:2小时-6小时
系统说明比定稿版少大学生联合比对库,其他数据库一致。出结果快,价格相对低廉,不支持验证,适合在修改中期使用,定稿推荐PMLC。——不支持验证!!!
检查范围本/专科毕业论文
288.00元/篇
立即检测
检查语种:中文 预计时间:60分钟
系统说明论文检测网站,万方数据平台推出的万方查重系统是目前较为热门的检测系统。究其原因,万方数据通过近年的发展,在高校中也确立了自己的相应地位,特别是部分高校直接将其视为毕业检测系统,其真实性和权威性无可厚非。其次,相对于知网而言,万方检测费用少,上手容易,是学生初次论文查重的推荐系统。
检查范围毕业论文、期刊发表
4.00元/千字
立即检测
检查语种:中文/英文 预计时间:60分钟
系统说明学位论文查重,维普查重系统是国内知名数据公司。本系统含有硕博库、期刊库和互联网资源等。支持中文、英文、繁体、小语种论文检测,最多支持1万字符。--不支持指定院校!!!
检查范围毕业论文、期刊发表
35.00元/篇
立即检测
检查语种:中文,英文,小语种 预计时间:24小时-72小时
系统说明本科定稿查重版(一般习惯叫本科终评版),论文抄袭检测系统,专用于大学生专、本科等论文检测的系统,大多数专、本科院校使用此检测系统。(限制字符数6万)
检查范围专科/本科大学生论文
388.00元/篇
立即检测
检查语种:中文 预计时间:60分钟
系统说明PaperPass检测系统是北京智齿数汇科技有限公司旗下产品,网站诞生于2007年,运营多年来,已经发展成为国内可信赖的中文原创性检查和预防剽窃的在线网站。 系统采用自主研发的动态指纹越级扫描检测技术,该项技术检测速度快、精度高,市场反映良好。
检查范围学位论文和学术期刊
3.00元/千字
立即检测
检查语种:中文,英文,小语种 预计时间:3小时-72小时
系统说明amlc职称论文检测,期刊职称查重系统是期刊、杂志社专用,是针对投稿发表、已发表文献、学校、事业单位业务报告、职称评审论文的重复率检测系统。
检查范围投稿/发表/职称评审
3.00元/千字
立即检测
检查语种:中文 预计时间:60分钟
系统说明格子达依托学术期刊库收录了海量对比资源,其中包括中国论文库、中文学术期刊库、中国学位论文库等国内齐全的论文库以及数亿级网络资源,同时本地资源库以每月100万篇的速度增加,是目前中文文献资源涵盖全面的论文检测系统,可检测中文、英文两种语言的论文文本。
检查范围毕业论文、期刊发表
4.00元/千字
立即检测
检查语种:简体中文、英文 预计时间:60分钟
系统说明PaperTime论文查重系统,拥有海量的对比数据库,总收录超过9000万的学术期刊和学位论文以及一个超过10亿数量的互联网网页数据库组成,保证了比对源的专业性和广泛性。采用多级指纹对比技术结合深度语义发掘识别比对,利用指纹索引快速而精准地在云检测服务部署的论文数据资源库中找到所有相似的片段,该项技术检测速度快、准确率高,市场反映良好。
检查范围毕业论文、期刊发表
2.00元/千字
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